表達產物的分離純化

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1、五、外源基因表達產物的分離純化五、外源基因表達產物的分離純化(一)重組蛋白分離純化方法選擇的原則(一)重組蛋白分離純化方法選擇的原則(一)重組蛋白分離純化方法選擇的原則(一)重組蛋白分離純化方法選擇的原則針對不同的產物表達形式采取不同的策略針對不同的產物表達形式采取不同的策略針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術的聯合運用多種分離純化技術的聯合運用合適分離純化介質的選擇合適分離純化介質的選擇分離純化過程的規?;蛛x純化過程的規?;?、針對產物的表達形式采取不同的策略、針對產物的表達形式采取不同的策略應先離心回收包涵體。應先離心回收包涵體

2、。樣樣品品體體積積大大、濃濃度度低低,應應在在純純化化前采用沉淀、超濾等方法濃縮處理。前采用沉淀、超濾等方法濃縮處理。一一般般是是胞胞內內可可溶溶性性的的,首首選選親親和和層析純化。層析純化。包涵體型表達:包涵體型表達:分泌型表達:分泌型表達:融合型表達:融合型表達:2、針對重組蛋白的性質選擇不同的層析類型、針對重組蛋白的性質選擇不同的層析類型1)離子交換層析:)離子交換層析:是是等等電電點點處處于于極極端端區區域域(pI5或或pI8)重重組蛋白的首選,易除去幾乎所有的雜蛋白。組蛋白的首選,易除去幾乎所有的雜蛋白。前前提提是是具具備備重重組組蛋蛋白白的的特特異異性性配配體體,如如抗抗體體、受受

3、體體、底底物物等等,且且它它們們與與目目標標蛋蛋白白間間的解離常數的解離常數Kd為為10-8-10-4 mol/L。2)親和層析:)親和層析:3)疏水層析)疏水層析:根據蛋白質的疏水性差異分離。根據蛋白質的疏水性差異分離。4)凝膠過濾層析)凝膠過濾層析:根據蛋白的分子量差異分離。根據蛋白的分子量差異分離。3、多種分離純化技術的聯合運用、多種分離純化技術的聯合運用重組蛋白純化時,通常需綜合使用多種技術。重組蛋白純化時,通常需綜合使用多種技術。首先選擇能除去含量最多雜質的方法;首先選擇能除去含量最多雜質的方法;選擇分離純化方法時,應遵循下列選擇分離純化方法時,應遵循下列原則原則:選擇不同分離純化機

4、理的方法聯合使用;選擇不同分離純化機理的方法聯合使用;盡量選擇高效的分離方法;盡量選擇高效的分離方法;將最費時、成本最高的分離純化方法排在最后。將最費時、成本最高的分離純化方法排在最后。4、合適分離純化介質的選擇、合適分離純化介質的選擇常用的分離純化介質:常用的分離純化介質:葡聚糖凝膠(葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠(Sepherose)對目標蛋白有較高的分離效率;對目標蛋白有較高的分離效率;理想的分離純化介質應具有下列理想的分離純化介質應具有下列性質性質:對目標蛋白不會造成變性;對目標蛋白不會造成變性;化學性能、機械性能穩定,重復性好;化學性能、機械性能穩定,重復性好;

5、價格低廉。價格低廉。5、分離純化過程的規?;?、分離純化過程的規?;?蛋蛋白白質質分分離離純純化化的的實實驗驗室室方方法法,在在產產業業化化過過程程未必合適,如:未必合適,如:實驗室方法在工程上難以實現,如實驗室方法在工程上難以實現,如超聲超聲波破碎胞壁。波破碎胞壁。實驗室方法在規?;a中成本過高,如超速實驗室方法在規?;a中成本過高,如超速離心離心。因此,實驗室的技術路線因此,實驗室的技術路線=生產工藝。生產工藝。(二)透析和超濾(二)透析和超濾(二)透析和超濾(二)透析和超濾透析:透析:利利用用具具有有一一定定孔孔徑徑大大小小、高高分分子子溶溶質質不不能能透透過過的的親親水水膜膜,將將含

6、含有有高高分分子子溶溶質質和和其其它它小小分分子子溶溶質質的的溶溶液液(左左側側)與與純純水水或或緩緩沖沖液液(右右側側)分分隔隔,由由于于膜膜兩兩側側的的溶溶質質濃濃度度不不同同,在在濃濃度度差差的的作作用用下下,左左側側中中的的小小分分子溶質透向右側,右側中的水或緩沖液透向左側。子溶質透向右側,右側中的水或緩沖液透向左側。將將蛋蛋白白質質樣樣品品裝裝入入透透析析袋袋,置置于于盛盛有有足足量量透透析析液液的的容容器器中中透透析析,當當袋袋內內、外外小小分分子子趨趨于于平平衡衡時時,更更換換透透析析液液,產產生生新新的的濃濃度度差差,小小分分子子繼繼續續向向外外擴擴散散,如如此此多多次次重重復

7、復,即即可可將將大大分分子子和和小小分分子子分分離離,分分離離取取決決于透析袋的截留分子量。于透析袋的截留分子量。脫鹽;脫鹽;去除小分子雜質;去除小分子雜質;置換緩沖液。置換緩沖液。透析的用途:透析的用途:實驗室規模的蛋白質分離純化。實驗室規模的蛋白質分離純化。加壓加壓蛋白質溶液蛋白質溶液半透膜半透膜支持膜的柵板支持膜的柵板超濾液超濾液 超濾:超濾:具具有有一一定定孔孔徑徑的的半半透透膜膜在在一一定定壓壓力力下下,膜膜內內小小分分子子能能通通過過膜膜孔孔滲滲透透到到膜膜外外,而而大大分分子子不不能能通通過過,使使大小不同的分子達到分離的目的。大小不同的分子達到分離的目的。實實際際上上是是一一種

8、種高高壓壓滲滲透透分分離離方方法法,通通過過在在膜膜內內施施加加正正壓壓、或或在在膜膜外施加負壓,使小分子排出膜外。外施加負壓,使小分子排出膜外。超濾的用途:超濾的用途:脫鹽;脫鹽;去除小分子雜質;去除小分子雜質;濃縮;濃縮;除菌。除菌。(三)離子交換層析(三)離子交換層析(三)離子交換層析(三)離子交換層析離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換介質的基本性質離子交換介質的基本性質離子交換介質的選擇原則離子交換介質的選擇原則離子交換層析的基本操作離子交換層析的基本操作1、離子交換層析的基本原理、離子交換層析的基本原理 以以離離子子交交換換劑劑為為固固定定相相、以以特特定定含含離離

9、子子溶溶液液為為流流動動相相,利利用用離離子子交交換換劑劑與與待待分分離離的的各各種種離離子子結結合合力力的的差差異異,將將混混合合物物中中不不同同離離子進行分離的層析技術。子進行分離的層析技術。不不結結合合的的先先被被洗洗脫脫下下來來,結結合合力力弱弱的的其其次次,結結合合力力強強的的后后被被洗洗脫脫下下來。來。陽離子交換層析陽離子交換層析2、離子交換劑的基本性質、離子交換劑的基本性質1)亦亦稱稱離離子子交交換換介介質質,為為不不溶溶性性高高分分子子化化合合物物,如樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。如樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。2)所所含含可可解解離離基基團團在在水水溶溶液液中中能能與與其

10、其它它陰陰、陽陽離離子起交換作用。子起交換作用。3)若若有有兩兩種種以以上上成成分分吸吸附附在在離離子子交交換換劑劑上上,各各成成分被洗脫的可能性取決于各自反應的解離常數。分被洗脫的可能性取決于各自反應的解離常數。4)通通過過改改變變pH,可可使使吸吸附附在在離離子子交交換換劑劑上上的的蛋蛋白質失去電荷而解離下來。白質失去電荷而解離下來。5)不不同同蛋蛋白白質質與與離離子子交交換換劑劑之之間間形形成成離離子子鍵鍵的的數數目目不不同同,即即結結合合力力大大小小不不同同,選選擇擇適適當當的的洗洗脫脫條條件件(如如改改變變離離子子強強度度),可可將將混混合合物物中中的的成成分分逐個洗脫下來。逐個洗脫

11、下來。離子交換劑的分類離子交換劑的分類帶正電荷,結合帶帶正電荷,結合帶負電荷的蛋白質負電荷的蛋白質 強堿型強堿型弱堿型弱堿型陽離子交換劑:陽離子交換劑:陰離子交換劑:陰離子交換劑:選擇陰離子還是陽離子交換劑,決定于被分離選擇陰離子還是陽離子交換劑,決定于被分離物質所帶的電荷性質。物質所帶的電荷性質。帶負電荷,結合帶帶負電荷,結合帶正電荷的蛋白質正電荷的蛋白質強酸型強酸型弱酸型弱酸型強離子交換劑:強離子交換劑:弱離子交換劑:弱離子交換劑:電電離離率率受受pH影影響響很很大大,離離子子交交換換作作用用的的pH范圍窄。范圍窄。電電離離率率基基本本不不受受pH影影響響,離離子子交交換換作作用用的的pH

12、范圍寬。范圍寬。pH降低時,電離率逐漸降低,離子降低時,電離率逐漸降低,離子交換交換能力逐漸減弱。能力逐漸減弱。弱陰離子交換劑:弱陰離子交換劑:弱陽離子交換劑:弱陽離子交換劑:pH升高時,電離率逐漸降低,離子升高時,電離率逐漸降低,離子交換交換能力逐漸減弱。能力逐漸減弱。常用的離子交換劑常用的離子交換劑1)離子交換樹脂)離子交換樹脂 常常見見的的是是含含酸酸性性或或堿堿性性基基團團、人人工工合合成成的的聚苯乙烯聚苯乙烯-二乙烯苯不二乙烯苯不溶性高分子化合物。溶性高分子化合物。優優點點:流流速速快快,對對小小分分子子物物質質的的交交換換容容量量大大,適于氨基酸、核苷酸等適于氨基酸、核苷酸等小分子

13、小分子物質的純化。物質的純化。2 2)離子交換纖維素)離子交換纖維素)離子交換纖維素)離子交換纖維素 是是是是攜攜攜攜帶帶帶帶功功功功能能能能基基基基團團團團的的的的纖纖纖纖維維維維素素素素衍衍衍衍生生生生物物物物,有有有有松松松松散散散散的的的的親親親親水水水水性性性性網網網網狀狀狀狀結結結結構構構構和和和和較較較較大大大大表表表表面面面面積積積積,大大大大分分分分子子子子可可可可自自自自由由由由通通通通過過過過,對對對對蛋蛋蛋蛋白白白白質質質質等等等等生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子的的的的交交交交換換換換容容容容量量量量比比比比離離離離子子子子交交交交換樹脂大。換樹脂大。換樹脂大

14、。換樹脂大。陽離子型:陽離子型:羥甲基纖維素羥甲基纖維素(CM纖維素纖維素);陰離子型:陰離子型:二乙基氨基乙基纖維素二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素纖維素)。3)離子交換葡聚糖)離子交換葡聚糖 是是葡葡聚聚糖糖經經環環氧氧氯氯丙丙烷烷交交聯聯后后形形成成的的、具具有有多多孔孔三三維維空空間間網網狀狀結結構構、離離子子交交換換功功能能基團的多糖衍生物?;鶊F的多糖衍生物。1)親親水水性性強強,不不會會引引起起生生物物分分子子的的變變性性、失失活活,母鏈對蛋白質、核酸等的非特異性吸附小。母鏈對蛋白質、核酸等的非特異性吸附小。優點:優點:2)電電離離基基團團在在母母體體上上取取代代程程度度高高、

15、交交換換容容量量大大、裝柱方便、流速快。裝柱方便、流速快。3)既有離子交換作用,又有分子篩效應。)既有離子交換作用,又有分子篩效應。常用的離子交換葡聚糖:常用的離子交換葡聚糖:C后面的數字后面的數字=凝膠吸水量凝膠吸水量 10 C-25:表示:表示1g干燥的凝膠可吸水干燥的凝膠可吸水2.5ml DEAE-Sephadex A-25 Q-Sephadex A-25 DEAE-Sephadex A-50 Q-Sephadex A-50 CM-Sephadex C-25 SP Sephadex C-25 CM-Sephadex C-50 SP Sephadex C-50 陽離子型:陽離子型:陰離子型

16、:陰離子型:4)離子交換瓊脂糖)離子交換瓊脂糖CM-Sepharose 是是攜攜帶帶DEAE或或CM基基團團的的Sepharose CL-6B,具具有有硬硬度度大大、性性質質穩穩定定、流流速速好好、分分離離能能力力強強等等優優點點,受受pH和和離離子子強強度度影影響響引引起起的的膨膨脹脹和和收收縮縮效效應應小,外形和體積穩定。小,外形和體積穩定。DEAE-Sepharose陰離子型陰離子型:陽離子型陽離子型:3、離子交換介質的選擇原則、離子交換介質的選擇原則堿性物質堿性物質:用陽離子交換劑分離。:用陽離子交換劑分離。酸性物質酸性物質:用陰離子交換劑分離。:用陰離子交換劑分離。兩性電解質兩性電解

17、質(如(如氨基酸、核苷酸、蛋白質):氨基酸、核苷酸、蛋白質):根據其根據其pI值及離子化曲線來選擇。值及離子化曲線來選擇。12346789105pH+-蛋蛋白白質質凈凈電電荷荷等電點等電點吸附陰離子交換劑吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑吸附陽離子交換劑pHpI(-)對對pI=5的某蛋白質:的某蛋白質:在在pH5.5-9.0范圍內,范圍內,蛋白質為陰離子,蛋白質為陰離子,首選首選DEAE纖維素。纖維素。在在pH3.5-4.5范圍內,范圍內,蛋白質為陽離子,蛋白質為陽離子,首選首選CM纖維素。纖維素。層析柱平衡層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍;倍;平衡緩沖

18、液的流速可略高于正常操作流速;平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速;平衡終點以流出液的離子濃度、導電性、平衡終點以流出液的離子濃度、導電性、pH值值與緩沖液一致為準,其中與緩沖液一致為準,其中pH值最重要。值最重要。4、離子交換層析的基本操作、離子交換層析的基本操作樣品進柱樣品進柱交換容量:交換容量:離子交換劑中可交換的離子或功能基團的總數。離子交換劑中可交換的離子或功能基團的總數。為為達達滿滿意意的的分分離離效效果果,進進樣樣量量一一般般為為介介質質交交換換容量的容量的10-20%。為為避避免免進進樣樣溶溶液液中中的的離離子子強強度度過過高高,樣樣品品濃濃度度不宜太高不宜太高。樣品洗脫樣品洗

19、脫恒定洗脫恒定洗脫梯度洗脫梯度洗脫線性洗脫線性洗脫101020203030404050506060707080809090分子濃度分子濃度離子強度離子強度pH值值(四)凝膠層析(四)凝膠層析(四)凝膠層析(四)凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠層析的基本原理凝膠介質的基本性質凝膠介質的基本性質凝膠介質的選用原則凝膠介質的選用原則凝膠層析的基本操作凝膠層析的基本操作1、凝膠層析的基本原理、凝膠層析的基本原理 凝膠層析是以有一定孔徑范圍的多孔凝凝膠層析是以有一定孔徑范圍的多孔凝膠為固定相,對混合物中各組份按分子大小膠為固定相,對混合物中各組份按分子大小進行分離的層析技術,又稱進行分離的層析技術,又稱分

20、子篩分子篩。2、小小分分子子物物質質要要通通過過凝凝膠膠網網孔孔進進入入凝凝膠膠顆顆粒粒內內部部,遷遷移移速速度慢度慢。1、大大分分子子物物質質不不能能進進入入凝凝膠膠顆顆粒粒內內部部,隨隨洗洗脫脫液液從從凝凝膠膠顆顆粒粒之之間間的的空空隙隙擠擠落落下下來來,遷遷移移速度快速度快;原理:原理:分分子子直直徑徑比比凝凝膠膠最最大大孔孔隙隙直直徑徑大大的的,會會被被全全部部排排阻阻在在凝凝膠膠顆顆粒粒之之外外,即即使使大大小小不不同同,也也不不能能分開,它們的下行速度快。分開,它們的下行速度快。分分子子直直徑徑比比凝凝膠膠最最小小孔孔隙隙直直徑徑小小的的,能能進進入入凝凝膠膠顆顆粒粒的的全全部部孔

21、孔隙隙,即即使使大大小小不不同同,也也不不能能分分開,它們的下行速度慢。開,它們的下行速度慢。注意:注意:2 2、凝膠介質的基本性質、凝膠介質的基本性質、凝膠介質的基本性質、凝膠介質的基本性質 葡葡聚聚糖糖凝凝膠膠對對堿堿穩穩定定,在在酸酸性性環環境境中中糖糖苷苷鍵鍵易易水水解解;濕濕態態的的葡葡聚聚糖糖可可加加熱熱到到110,干干的的能能耐受耐受120高溫。高溫。1)葡聚糖凝膠)葡聚糖凝膠 種種類類有有Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200,G50表表示示1g干干凝凝膠膠吸水量為吸水量為5ml。Sephadex LH是是羥羥丙丙基基化化的的Se

22、phadex,流流動動相相既既可可使使用用緩緩沖沖水水溶溶液液,也也可可使使用用極極性性有有機機溶溶劑劑,因因此此適適用用于于非非水水溶溶性性溶溶質質的的凝凝膠膠過濾。過濾。Sepharose:Sepharose 2B、4B、6B (數字代表干膠的百分比)數字代表干膠的百分比)Bio-Gel-A:Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M (數字(數字106代表排阻限度)代表排阻限度)2)瓊脂糖凝膠)瓊脂糖凝膠 瓊瓊脂脂糖糖凝凝膠膠是是從從瓊瓊脂脂中中分分離離出出的的天天然然凝凝膠膠,常見的有:常見的有:溫溫度度高高于于50時時,瓊瓊脂脂糖糖凝凝膠膠融融化化,只只能

23、能在在較低溫度下使用。較低溫度下使用。瓊瓊脂脂糖糖凝凝膠膠是是一一種種大大孔孔凝凝膠膠,適適于于分分離離分分子子量較大的生物大分子(如蛋白質、量較大的生物大分子(如蛋白質、DNA)。Sepharose CL是是二二溴溴丙丙醇醇交交聯聯瓊瓊脂脂糖糖,孔孔徑徑大大小小和和分分離離范范圍圍同同普普通通瓊瓊脂脂糖糖,但但熱熱和和化化學學穩穩定定性增加,能性增加,能高溫高溫消毒。消毒。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝膠膠商商品品名名為為Bio-Gel,型型號號從從P-2至至P-300共共10種(數字種(數字1000為排阻限度)。為排阻限度)。3)聚丙烯酰胺凝膠)聚丙烯酰胺凝膠 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝膠膠是是一

24、一種種以以丙丙烯烯酰酰胺胺為為單單位位、由甲叉雙丙烯酰胺交聯而成的人工合成凝膠。由甲叉雙丙烯酰胺交聯而成的人工合成凝膠??乜刂浦平唤宦撀搫﹦┑牡挠糜昧苛靠煽芍浦瞥沙筛鞲鞣N種型型號號的的凝凝膠膠,交聯劑越多、孔隙越小。交聯劑越多、孔隙越小。3、凝膠介質的選用原則、凝膠介質的選用原則 將將樣樣品品中中的的大大分分子子和和小小分分子子物物質質分分開開,稱稱為為組組別別分分離離,分分離離策策略略是是使使高高分分子子物物質質完完全全被被排排阻阻,小分子物質完全滲入凝膠內。小分子物質完全滲入凝膠內。1)組別分離)組別分離 一一般般選選Sephadex G-25或或G-50,對對于于小小肽肽和和小小分分子子

25、物物質質的的脫脫鹽鹽,可可選選Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或或P-4。將將樣樣品品中中一一些些分分子子量量較較接接近近的的物物質質分分開開,稱為稱為分級分離分級分離。2)分級分離)分級分離 一一般般選選排排阻阻限限度度略略大大于于樣樣品品中中最最高高分分子子量量物物質質的的凝凝膠膠。樣樣品品中中各各組組份份均均能能不不同同程程度度地地深深入入凝凝膠膠內內部部,由由于于深深入入凝凝膠膠空空隙隙程程度度的的差差異異,得以分離。得以分離。4、凝膠層析的基本操作、凝膠層析的基本操作注意凝膠的斷層和氣泡。注意凝膠的斷層和氣泡。層析柱平衡:層析柱平衡:操作壓控制:操作壓控制

26、:恒定的操作壓是恒流的先決條件。恒定的操作壓是恒流的先決條件。平衡溶液的流速應低于層析時需要的流速;平衡溶液的流速應低于層析時需要的流速;平衡和洗脫時應維持流速恒定;平衡和洗脫時應維持流速恒定;上柱樣品溶液的體積根據分離要求確定:上柱樣品溶液的體積根據分離要求確定:進樣體積進樣體積分分級級分分離離:樣樣品品溶溶液液的的體體積積要要小小(1-2%),使使樣品層盡可能窄,這樣洗脫出的峰形好。樣品層盡可能窄,這樣洗脫出的峰形好。組別分離組別分離:樣品溶液最大可為柱體積的:樣品溶液最大可為柱體積的10%;(五)親和層析(五)親和層析(五)親和層析(五)親和層析親和層析的基本概念親和層析的基本概念親和層

27、析載體的性質與選擇親和層析載體的性質與選擇親和層析配基的性質與選擇親和層析配基的性質與選擇親和層析的基本操作親和層析的基本操作1、親和層析的基本概念、親和層析的基本概念 親親和和層層析析是是利利用用待待分分離離物物質質與與其其特特異異性性配配體體之之間間的的特特異異性性親親和和力力,進進行行分分離離的的一類一類特殊的層析技術。特殊的層析技術。親和層析的基本特點親和層析的基本特點1)純化過程簡單、迅速,分離效率高。)純化過程簡單、迅速,分離效率高。特點:特點:2)特特別別適適于于分分離離純純化化含含量量低低、穩穩定定性性差差的的生生物物大分子。大分子。4)必必須須針針對對某某一一分分離離對對象象

28、,制制備備專專一一配配基基,應應用范圍受一定限制。用范圍受一定限制。3)產物純度高。)產物純度高??乖c抗體;抗原與抗體;DNA與互補與互補DNA或或RNA;酶與其底物、競爭性抑制劑、輔酶因子;酶與其底物、競爭性抑制劑、輔酶因子;激素或藥物與其受體;激素或藥物與其受體;維生素與其特異性結合蛋白;維生素與其特異性結合蛋白;糖蛋白與其相應的植物凝集素。糖蛋白與其相應的植物凝集素。具有特異性親和作用的生物分子具有特異性親和作用的生物分子1)親親和和的的一一對對分分子子中中,一一方方以以共共價價鍵鍵與與不不溶溶性性載體相連作為固定相吸附劑;載體相連作為固定相吸附劑;親和層析的基本原理親和層析的基本原理

29、2)當當樣樣品品(流流動動相相)通通過過固固定定相相時時,只只有有與與其其有有特特異異親親和和力力的的物物質質,才才能能被被吸吸附附,無無關關組組份份隨隨流流動相流出;動相流出;3)改變流動相成份,將結合的親和物洗脫下來。)改變流動相成份,將結合的親和物洗脫下來。2、親和層析載體的性質與選擇、親和層析載體的性質與選擇有多孔立體網狀結構,能使吸附的大分子自由通過;有多孔立體網狀結構,能使吸附的大分子自由通過;親和層析載體的選擇親和層析載體的選擇均勻珠狀顆粒具有良好的機械性能、良好的流速;均勻珠狀顆粒具有良好的機械性能、良好的流速;有相當量的易活化基團,溫和條件下能與配基共價偶聯;有相當量的易活化

30、基團,溫和條件下能與配基共價偶聯;具有惰性,盡量減少非專一性吸附;具有惰性,盡量減少非專一性吸附;在偶聯、吸附和洗脫時,有較好的理化穩定性。在偶聯、吸附和洗脫時,有較好的理化穩定性。纖維素纖維素葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠常用的親和層析載體常用的親和層析載體3 3、親和層析配基的性質與選擇、親和層析配基的性質與選擇、親和層析配基的性質與選擇、親和層析配基的性質與選擇純化對象和配基之間必須有較強的親和力;純化對象和配基之間必須有較強的親和力;親和層析配基的選擇親和層析配基的選擇親親和和力力太太高高也也有有害害,在在解解離離配配基基復復合合物物時時所所需需的

31、條件就強烈,可能使生物分子變性;的條件就強烈,可能使生物分子變性;配配基基必必須須有有適適當當的的化化學學基基團團,用用于于連連接接載載體體,基基團團不不參參與與配配基基和和生生物物分分子子之之間間特特異異結結合合,也也不影響二者的親和力。不影響二者的親和力。酸酐法酸酐法N-取代羥基琥珀酰亞胺法取代羥基琥珀酰亞胺法疊氮化作用疊氮化作用還原性烷基化合物還原性烷基化合物(西夫堿西夫堿)的形成的形成配基的偶聯配基的偶聯4、親和層析的基本操作、親和層析的基本操作 采采用用改改變變pH、離離子子強強度度、離離子子種種類類、溫溫度度,使使與與固固定定配配基基結結合合的的生生物物大大分分子子構構象發生變化,

32、降低其親和力。象發生變化,降低其親和力。1)非專一性洗脫)非專一性洗脫 使用廣泛的是改變溶液的使用廣泛的是改變溶液的離子強度離子強度。使用使用特異的配基特異的配基作為洗脫劑。作為洗脫劑。2)專一性洗脫)專一性洗脫 使使用用含含有有與與親親和和配配基基或或目目標標產產物物有有親親和和作作用用的的小小分分子子化化合合物物溶溶液液為為洗洗脫脫劑劑,通通過過競競爭性結合,來洗脫目標產物。爭性結合,來洗脫目標產物。含配體溶液含配體溶液混合蛋混合蛋白樣品白樣品平衡液平衡液帶帶有有配配體體的的樹樹脂脂珠珠收集目收集目的蛋白的蛋白洗下未結洗下未結合的蛋白合的蛋白目的蛋白目的蛋白配體配體配體與配體與樹脂珠結合樹

33、脂珠結合 實實際際上上,特特殊殊性性洗洗脫脫法法是是一一種種非非特特異異性性洗脫方法。洗脫方法。3)特殊性洗脫)特殊性洗脫 若若親親和和雙雙方方吸吸附附能能力力很很強強,可可用用專專一一的的化化學學方方法法,裂裂解解配配基基與與載載體體的的連連接接鍵鍵,獲獲得得配基配基-蛋白絡合物后,再除去配基。蛋白絡合物后,再除去配基。(六)重組蛋白的質量檢測(六)重組蛋白的質量檢測(六)重組蛋白的質量檢測(六)重組蛋白的質量檢測 工業化生產的重組蛋白必須經過嚴格的質量工業化生產的重組蛋白必須經過嚴格的質量控制才能成為產品??刂撇拍艹蔀楫a品。重組蛋白的質量控制指標:重組蛋白的質量控制指標:鑒別(序列)鑒別(

34、序列)純度(雜質的類型)純度(雜質的類型)活性(檢測方法)活性(檢測方法)安全性安全性穩定性穩定性一致性(構象與構型)一致性(構象與構型)原核細菌表達的重組蛋白產物的質量檢測項目與方法原核細菌表達的重組蛋白產物的質量檢測項目與方法檢測項目檢測項目 檢測方法檢測方法是否含內毒素是否含內毒素是否變異是否變異甲硫氨酸是否被甲?;琢虬彼崾欠癖患柞;?是否變性、聚合、脫氨基是否變性、聚合、脫氨基配體是否脫落配體是否脫落 氨基酸是否發生取代氨基酸是否發生取代 是否被細菌、病毒、支原體污染是否被細菌、病毒、支原體污染家兔熱原法家兔熱原法肽譜、肽譜、HPLC、等電聚焦、毛細管電泳等電聚焦、毛細管電泳肽譜、質譜、肽譜、質譜、HPLC、Edman分析分析SDS-PAGE、凝膠層析、等電聚焦、質凝膠層析、等電聚焦、質譜、譜、HPLC、毛細管電泳、毛細管電泳、Edman分析分析SDS-PAGE、免疫分析免疫分析氨基酸分析、肽譜、質譜、毛細管電泳氨基酸分析、肽譜、質譜、毛細管電泳微生物學檢測微生物學檢測

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